2.1. Posúdenie obsahu celkových polyfenolov (TPC)

Výsledky spektrofotometrického stanovenia extraktov zo smrekovej kôry TPC sú uvedené na obrázku 1a, ako mg GAE na g rastlinného materiálu.

Ako možno pozorovať, variant MD US mal najvyššiu TPC (43,64 ± 10,52 mg/g), ale obsah bol významne vyšší len v porovnaní s MT M a MD M. Najnižšia TPC bola zaznamenaná pre variant MT M (19,54 ± 1,79 mg/g), ktorý mal výrazne nižšie hladiny fenolových zlúčenín v porovnaní s ostatnými variantmi okrem MD M. Možno tiež poznamenať, že extrakty získané prostredníctvom SAE sú spojené s vyšším TPC. Každý variant získaný touto extrakčnou metódou mal vyšší TPC ako varianty získané MAE, avšak jediné významné rozdiely sa vyskytli medzi experimentálnymi variantmi MT (US a M) a MD (US a M). Hoci sa medzi jednotlivými zbernými miestami vyskytli malé rozdiely, neboli zaznamenané žiadne významné rozdiely týkajúce sa TPC.

Podobné výsledky dosiahli aj ďalšie štúdie týkajúce sa TPC výťažkov zo smrekovej kôry, ktoré dosiahli Spojené arabské emiráty. Napríklad štúdia, ktorá používala takmer identické parametre kôry P. abies pre Spojené arabské emiráty, identifikovala TPC okolo 40 mg GAE/g, čo naznačuje podobnosť výsledkov [44]. Ďalšia základná štúdia, ktorá sa tiež zamerala na Spojené arabské emiráty kôry P. abies, dosiahla TPC extraktov 28,73 ± 0,08 mg GAE/g, čím zaznamenala nižšiu hladinu fenolových zlúčenín v porovnaní s väčšinou našich experimentálnych variantov. V tejto základnej štúdii sa však uskutočnila vodná extrakcia, a nie hydroalkoholická, s použitím vyššej extrakčnej teploty (70 °C) a kratšieho času extrakcie (15 min) v porovnaní s našimi extrakčnými parametrami [45].

Sládková A. a kol. vykonali štúdiu o extraktoch z kôry P. abies dosiahnutých MAE, pričom naznačila maximálny TPC 321,1 mg GAE na 100 g suchej kôry. Hoci tieto výsledky ukázali nižší výťažok fenolových zlúčenín v porovnaní s našimi výsledkami pre extrakty získané MAE, je potrebné spomenúť, že bol použitý iný protokol MAE [46].

Tieto údaje ukazujú, že Spojené arabské emiráty môžu byť efektívnejšou extrakčnou technikou na dosiahnutie vyšších výnosov fenolových zlúčenín z kôry P. abies.

2.2. Posúdenie obsahu celkových trieslovín (TTC)

Výsledky týkajúce sa TTC sú znázornené na obrázku 1b ako mg pyrogallolu na g rastlinného materiálu. Zistilo sa, že najvyššia TTC bola zaznamenaná pre variant M1 M (19,34 ± 4,88 mg/g); medzi experimentálnymi variantmi sa však nevyskytol žiadny významný rozdiel okrem MT M, pre ktoré bola zistená významne nižšia hladina trieslovín (7,56 ± 0,65 mg/g). Hoci po porovnaní extraktov neboli zaznamenané takmer žiadne významné rozdiely, výsledky ukázali, že s extraktmi získanými v SAE boli spojené o niečo vyššie TTC, s výnimkou variantov M1, pri ktorých sa zdalo, že MAE vedie k mierne vyššiemu výťažku trieslovínu, ale rozdiel nebol významný. Rovnako ako v prípade TPC sa medzi zbernými miestami vyskytli menšie rozdiely, ale tieto rozdiely neboli významné.

Coșarcă SL a kol. kvantifikovali obsah trieslovín vo svojich výťažkoch z vodnej smrekovej kôry dosiahnutých v Spojených arabských emirátoch a dosiahli koncentráciu 11,4 mg pyrogallolu/g, čo naznačuje nižšiu hladinu TTC v porovnaní s našimi experimentálnymi variantmi [9]. Hoci metódy použité v tejto základnej štúdii boli podobné metódam použitým v tejto štúdii, rozdiel v čase extrakcie, teplote a rozpúšťadle môže byť dôvodom rozdielov vo výsledkoch. Údaje o obsahu trieslovín vo výťažkoch zo smrekovej kôry dosiahnutých MAE sa v literatúre nenašli.

Našli sa ďalšie štúdie týkajúce sa obsahu trieslovín v smrekovej kôre, ale tieto štúdie sa zamerali na vodnú extrakciu smrekovej kôry v pilotných mierkach [47,48].

2.3. Obsah terpenoidov

Po analýze GC-FID boli identifikované a kvantifikované prchavé zlúčeniny uvedené v tabuľke 1, pričom výsledky boli vyjadrené ako μg zlúčeniny na g rastlinného materiálu. Zistilo sa, že hlavnými terpenoidmi identifikovanými v smrekovej kôre boli α-pinén a β-pinén, pričom variant M1 M mal významne najvyšší obsah α-pinénu (2198,33 ± 0,25 μg/g), zatiaľ čo variant MD M mal najvyšší obsah β-pinénu (4312,24 ± 4,07 μg/g). Pokiaľ ide o menej hojné identifikované zlúčeniny, variant M2 M mal najvyšší obsah kamfénu, α-felandrénu, myrcénu a tricyklénu, variant MT M obsahoval najvyšší výťažok 3-karénu a limonénu, zatiaľ čo variant MD M mal tiež najvyšší obsah sabinénu zo všetkých testovaných extraktov. Väčšina výsledkov ukázala, že vyššie výťažky prchavých zlúčenín boli spojené s variantmi získanými metódou MAE, boli však identifikované aj výnimky. Napríklad vyššie hladiny kamfénu a myrcénu boli namerané vo variante MT US v porovnaní s MT M a obsah 3-karénu bol vyšší vo variantoch SAE v porovnaní s náprotivkami MAE, s výnimkou variantov MT. Okrem toho obsah α-felandrénu a limonénu bol vyšší v M1 US a M2 US v porovnaní s ich náprotivkami MAE.

V prípade obsahu prchavých terpenoidov malo zberné miesto významný vplyv. Napríklad v tabuľke 1 možno vidieť, že smreková kôra zozbieraná z Dolhasca (MD) mala výrazne najvyšší obsah β-pinénu, zatiaľ čo smreková kôra zozbieraná z lokality 1 národného parku Maramureșului Mountains mala najvyšší obsah α-pinénu aj v porovnaní s druhou lokalitou tej istej oblasti.

V štúdii uskutočnenej na extraktoch zo smrekovej kôry dosiahnutých Soxhletovou a superkritickou extrakciou CO₂ boli terpenoidy identifikované a kvantifikované, ale žiadna zo zlúčenín identifikovaných v tejto štúdii nezodpovedala ich výsledkom [49]. Dve ďalšie štúdie, ktoré sa zamerali na emisie prchavých organických zlúčenín zo smrekovej kôry, však naznačili, že zo smrekovej kôry boli emitované vysoké hladiny α- a β-pinénu, ale aj nižšie množstvá limonénu, 3-karénu, kamfénu, sabinénu, α-felandrénu a tricyklénu [50,51], tieto výsledky sú tiež podobné s našimi zisteniami.

2.4. Obsah jednotlivých polyfenolov

Hlavné vrcholy vyskytujúce sa v retenčných časoch 4,53 minúty a 5,25 minúty boli katechín a epikatechín. Vypočítaný obsah katechínu a epikatechínu sa nachádza v tabuľke 2. Pre vzorky SAE bol identifikovaný vyšší obsah katechínu a epikatechínu, zatiaľ čo pre varianty MAE bol zaznamenaný nižší výťažok týchto zlúčenín. V súlade s výsledkami získanými v obsahu TPC a trieslovín obsahujú vzorky M1 a MD najvyššie koncentrácie katechínu aj epikatechínu, tesne za nimi nasledujú vzorky MT. Očakávali sa vysoké koncentrácie katechínu a epikatechínu, pretože sú hlavnými monomérmi proantokyanidínov smrekovej kôry [47,48].

Žiadna zo vzoriek nemala zistiteľné hladiny kyseliny galovej, sinnapovej a vanilkovej, ani taxifolinu, hoci predchádzajúce správy naznačovali, že tieto zlúčeniny patria medzi polyfenoly nachádzajúce sa vo výťažkoch zo smrekovej kôry [44]. Tieto polyfenolové zlúčeniny sú však náchylné na degradáciu počas prípravy a extrakcie vzoriek. Naše výsledky navyše jasne naznačujú, že Spojené arabské emiráty sú efektívnejšie na extrakciu katechínu a epikatechínu zo smrekovej kôry. Naproti tomu Albuquerque a kol. ukázali, že mikrovlnná extrakcia je účinnejšia na extrakciu katechínu v porovnaní s extrakciou s ultrazvukom [52]. Tento nesúlad sa môže objaviť, pretože v základnej štúdii bola použitá iná rastlinná matrica a pre MAE bolo použité aj kontrolovanejšie prostredie. Degradácia katechínu a epikatechínu v našich variantoch MAE je však nepravdepodobná vzhľadom na skutočnosť, že tieto zlúčeniny trpia modifikáciami iba pri vyšších teplotách, ako sú tie, ktoré sme dosiahli v MAE [53].

2.5. Antioxidačná kapacita (AC)

2.6. Antibakteriálna aktivita

Antibakteriálna aktivita extraktov zo smrekovej kôry bola hodnotená proti grampozitívnym a gramnegatívnym bakteriálnym kmeňom stanovením MIC extraktov s cieľom vyhodnotiť účinnosť každého experimentálneho variantu proti každému testovanému kmeňu. Výsledky antibakteriálnej aktivity sú uvedené v tabuľke 3.

3.1. Materiály

Smreková kôra, ktorá sa používa na získanie testovaných extraktov, bola zozbieraná začiatkom jari z viacerých lokalít v Rumunsku. Zbernými miestami boli Tașca (46°53′34″ s. š., 26°02′05″ v. z. d.), župa Neamț, Dolhasca (47°25′49″ s. š., 26°36′34″ v. d.), župa Suceava a dve lokality v oblasti národného parku pohoria Maramureșului (47°47′05″ s. š., 24°34′20″ v. z. d.), župa Maramureș. Metóda itinerára bola použitá na zber vzoriek kôry od náhodne vybraných jedincov z každého miesta. Rastlinný materiál sa zbieral z výšky kmeňa približne 1,5 m. Vzorka poukážky bola uložená v herbári Katedry farmaceutickej botaniky, George Emil Palade, Univerzita medicíny, farmácie, vied a technológie v Tîrgu-Mureş, s referenčným číslom: 116/3–116/6. Posledný krok prípravy rastlinného materiálu spočíval v mletí vzoriek smrekovej kôry odobratých mlynčekom GRINDOMIX GM 200 (Retsch GmbH, Haan, Nemecko).

Na posúdenie antibakteriálnej aktivity prírodných extraktov boli použité grampozitívne a gramnegatívne bakteriálne kmene. Kmene Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus aureus rezistentný na meticilín (ATCC 43300), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603) a Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) boli použité a poskytnuté Katedrou mikrobiológie z Univerzity medicíny, farmácie, vied a technológie „G.E. Palade“ z Târgu-Mureș.

Činidlá ako etanol 96 % (v/v) používané na získanie 50 % a 70 % roztokov používaných na extrakciu a Na₂CO_3, ktoré sa používajú na prípravu roztokov používaných na hodnotenie celkového obsahu fenolu a tanínu, boli zakúpené od spoločnosti Chemical Company SA, Iași, Rumunsko. Kyselina gallová použitá na získanie kalibračnej krivky pre test celkového obsahu fenolu, činidlá 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) a 2,2′-azino-bis(kyselina 3-etylbenzotiazolín-6-sulfónová) (ABTS) používané na testy antioxidačnej aktivity a kožný prášok používaný na adsorpciu trieslovín a pyrogallol používaný ako externý štandard pre stanovenie obsahu trieslovín, boli získané od spoločnosti Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Nemecko), zatiaľ čo činidlo Folin-Ciocâlteu použité na fytochemické charakterizačné testy bolo získané od spoločnosti Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko).

Štandardy používané na chromatografické testy (GC-FID a UPLC-PDA) boli získané od spoločnosti Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Nemecko. Na analýzu obsahu prchavých zlúčenín extraktov GC-FID sa použilo deväť štandardov: α- a β-pinén (99,0 %), 3-karén (99,8 %), α-felandrén (98,9 %), limonén (99,7 %), sabínén (99,9 %), myrcén (99,8 %), kamfén (98,9 %) a tricyklén (99,8 %). Na analýzu extraktov UPLC-PDA boli použité štandardy od spoločnosti Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Nemecko: kyselina gallová – GAL (99 %), kyselina sinapová – SINAP (99 %), kyselina vanilová – VANIL (97 %), kyselina chlorogénová – CLR (99 %), kvercetín – QUER (95 %), taxifolin – TAXI (85 %), katechín – CAT (99 %), epikatechín – EPICAT (90 %), eleuterozid B – ELEB (98 %) a z extrasyntézového luteolín-7-O-glukozidu – LG (98 %), luteolín-3′, 7-diglukozid – LDG (97 %).

3.2. Extrakcia

Ultrazvukom asistované (SAE) a mikrovlnnými extrakciami (MAE) smrekovej kôry sa uskutočňovali v hydroalkoholických zmesiach s rôznou koncentráciou. Extrakčné protokoly pre obe extrakčné metódy boli predtým opísané v dvoch štúdiách vykonaných na bukovej kôre [34,65] a sú stručne uvedené v tabuľke 4.

Pri každej metóde sa vykonali dve extrakcie pre každú vzorku kôry, čo viedlo k dvom subvariantom pre každý experimentálny variant. Na každom z týchto subvariantov sa potom vykonali trojnásobné merania, čo viedlo k šiestim meraniam na variant pre všetky použité testy.

Po extrakčných postupoch vzniklo osem experimentálnych variantov uvedených v tabuľke 5.

3.3. Posúdenie obsahu celkových polyfenolov (TPC)

Na hodnotenie TPC bola použitá metóda Folin-Ciocâlteu [66], mierne upravená, ako už bolo spomenuté v jednej z našich štúdií [61]. Stručne povedané, 40 μl zriedeného extraktu (1:5) sa spojilo v injekčnej liekovke s destilovanou vodou, činidlom Folin-Ciocâlteu a 20% roztokom Na₂CO₃. Táto zmes sa potom uchovávala pri izbovej teplote 30 minút. Nakoniec bola absorbancia spektrofotometricky meraná pri vlnovej dĺžke 765 nm. Pre každý experimentálny variant bolo vykonaných šesť meraní. Kalibračná krivka bola použitá na vyjadrenie TPC ako ekvivalentov kyseliny galovej na gram rastlinnej matrice (mg GAE/g rastlinnej matrice).

3.4. Posúdenie obsahu celkových trieslovín (TTC)

Na stanovenie testovaných extraktov TTC bola použitá metóda použitá na stanovenie trieslovín v rastlinných liekoch [67]. Táto metóda využíva Folin-Ciocâlteuov test na hodnotenie TPC extraktov spektrofotometricky, pred a po ošetrení koženým práškom. Tento postup využíva vlastnosť trieslovín adsorbovať koženým práškom, teda rozdiel v absorbancii zaznamenaný pre testované vzorky pred a po ošetrení koženým práškom, nepriamo predstavuje absorbanciu adsorbovaných trieslovín. Absorbancia trieslovín sa preložila na TTC vyjadrenú ako mg pyrogallolu/g rastlinného materiálu použitím pyrogallolu ako externého štandardu. Presný pracovný protokol bol predtým opísaný [61], ale táto štúdia použila zriedenie extraktu 1:50 a 15% roztok Na₂CO₃.

3.5. Obsah terpenoidov

Na identifikáciu a kvantifikáciu potenciálnych prchavých zlúčenín prítomných v extraktoch kôry bola použitá plynová chromatografia s detekciou plameňovej ionizácie (GC-FID). Na tento postup bol použitý GC s kapilárnou kolónou TG-WAXMS spojený s detektorom FID. Interval linearity bol stanovený pomocou piatich kalibračných roztokov pripravených v duplikátoch. Pri výpočte koncentrácií sa zohľadnili hustoty zlúčenín a zo zásobného roztoku terpénov sa pripravila séria piatich riedení. Koncentrácie roztokov v kalibračných krivkách boli v rozmedzí nasledovne: pre C_{α-pinén β-pinén} = 23,55 – 1177,5 mg/l, pre C_kamfén = 11,85 – 150,3 mg/l, pre C_3-karán = 12,25 – 148 mg/l, pre C_{α-felandrén} = 0,5–10 mg/l, pre C_limonén = 20–150,6 mg/l, pre C_sabínén = 5–50 mg/l, pre C_myrcén = 24,27–485,4 mg/l, pre C_tricyklín = 5,15–122,1 mg/l. Ak boli signály dané niektorými vzorkami mimo intervalu linearity, vzorky sa zriedili, aby sa zmestili do rozsahu linearity metódy. Presnosť bola stanovená ako relatívna štandardná odchýlka (% RSD) vypočítaná pre tri opakované merania pre horné limitné koncentrácie kalibračnej krivky (t. j. C_{α-pinén, β-pinén} = 1177,5 mg/l, C_kamfén = 150,3 mg/l, C_3-karén = 148 mg/l, C_{α-felandrén} = 10 mg/l, C_limonén = 150,6 mg/l, C_sabinén = 50 mg/l, C_myrcén = 485,4 mg/l, C_tricyklén = 122,1 mg/l).

Extrakty boli priamo vstreknuté do GC a hélium (He) sa použilo ako nosný plyn. Proces identifikácie spočíval v porovnaní retenčných časov píkov z chromatogramu štandardného roztoku s retenčnými časmi píkov zaznamenaných na testovaných chromatogramoch extraktov. Identifikované zlúčeniny boli kvantifikované na základe ich výšky píku. Podrobný protokol analýzy bol predtým opísaný [61].

3.6. Obsah jednotlivých polyfenolov

Jednotlivé fenolové zlúčeniny z testovaných extraktov boli identifikované a kvantifikované pomocou ultraúčinnej kvapalinovej chromatografie (UPLC). Detektor použitý na analýzu UPLC pozostával z detektora fotodiódového poľa (PDA). Chromatografická separácia sa uskutočnila pri 35 °C na kolóne Luna C18 (2) 150 × 4,6 mm, 3 μm (Phenomenex). Mobilná fáza pozostávala zo zmesi kyseliny mravčej 0,1 % (A) a acetonitrilu (B). Gradientná elúcia bola: 0–0,1 min: 90 % A, 10 % B; 0,1–20,1 min: 90 %→ 20 % A; 20,1–25,1 min: 20 % A; 25,1–26,1 min: 20 % A → 90 % A; 26,1–30,1 min: 90 % A. Prietok bol 1 ml/min a vstrekovací objem bol 20 μl. Monitorovali sa vlnové dĺžky 210 nm, 280 nm a 370 nm. Proces identifikácie spočíval v porovnaní retenčných časov píkov na chromatograme štandardného roztoku s časmi na chromatogramoch extraktov. Zlúčeniny spojené s každým píkom boli potom kvantifikované na základe plochy píku a identifikované na základe podobnosti UV spektier v porovnaní so štandardnými roztokmi. Táto metóda bola opísaná aj v našej predchádzajúcej štúdii [61].

3.7. Antioxidačná kapacita (AC)

3.8. Antibakteriálna aktivita

Ako indikátor antibakteriálnej aktivity bola použitá minimálna inhibičná koncentrácia (MIC). Na hodnotenie MIC bola použitá metóda mikroriedenia, ktorá bola predtým načrtnutá [70]. Okrem tejto metódy sme použili resazurín na uľahčenie vizualizácie rastu baktérií v jamkách mikroplatničky [71]. Pre presnosť výsledkov boli extrakty najskôr podrobené kroku odparovania, aby sa odstránili všetky stopy etanolu, ktoré by mohli zmeniť antibakteriálnu aktivitu.

3.9. Štatistická interpretácia údajov

Rozdiely, ktoré sa vyskytli medzi obsahom TPC, TTC, AC a prchavých zlúčenín variantov, boli štatisticky interpretované pomocou jednosmerného testu ANOVA na zistenie potenciálnych rozdielov v priemeroch súborov údajov. Potom sa vykonal Tukeyho post hoc test, ak sa vyskytol nejaký priemerný rozdiel, aby sa identifikovali špecifické varianty, ktoré sa od seba významne líšia (úroveň významnosti α = 0,05, p ≤ 0,05). Vykonal sa aj Pearsonov korelačný test na posúdenie lineárnej korelácie medzi TPC a AC extraktov. Tieto testy boli vykonané v štatistickom softvéri GraphPad Prism 8.