1. Úvod

Mastné kyseliny (FA) sú v životnom prostredí rozšírené a sú hlavnými zložkami triacylglycerolov (TAG), fosfolipidov (PL) a ďalších lipidových zlúčenín [1]. Sú dôležité v biologických a metabolických funkciách, pretože sú kľúčovými zložkami bunkových organel. Zloženie FA bunkovej membrány je ovplyvnené genetikou, stravou, metabolizmom a hormónmi [1]. Fyzikálne a funkčné vlastnosti bunkových membrán vrátane signalizácie a prevádzky v rámci membrány sú ovplyvnené množstvom FA prítomných v membráne. Polynenasýtené FA (PUFA) sú široko prítomné v rastlinách a morských zdrojoch. Doteraz, keď sa preukázalo, že mnohé FA rastlinného pôvodu majú zápalové potláčacie účinky [1], by to mohla byť dobrá alternatíva k FA morských zdrojov so zmenšujúcimi sa populáciami rýb. Preto je potrebné preskúmať udržateľnejšie zdroje FA podporujúcich zdravie. Kyselina pinolénová (PNLA) ako FA rastlinného pôvodu teda môže byť kandidátom a v posledných rokoch sa stala populárnou vďaka svojej schopnosti potláčať chuť do jedla a znižovať hmotnosť [2]. PNLA je Δ5-nenasýtený polymetylénom prerušený FA (UPIFA) (obrázok 1). Jeho štruktúra je analogická so štruktúrou kyseliny linolovej (LA) (prekurzor kyseliny n-6 a γ-linolénovej (GLA)); GLA (prekurzor kyseliny n-6 a dihomo-γ-linolénovej (DGLA)) a kyselina α-linolénová (ALA; n-3 a pôvodca kyseliny dokosahexaénovej (DHA) a kyseliny eikosapentaénovej (EPA)) [3] (obrázok 1).

Niektoré PUFA, ako napríklad PNLA, sú príkladmi nutraceutík, o ktorých sa predpokladá, že majú protizápalové účinky prostredníctvom intracelulárnych signálov, ktoré aktivujú protizápalové dráhy, ako sú receptory aktivované peroxizómovým proliferátorom (PPAR) [4,5,6] a potláčajú prozápalové dráhy/mediátory, ako je nukleárny faktor kappa-zosilňovač ľahkého reťazca aktivovaných B buniek (NF-κB) [5,6], eikosanoidy odvodené od kyseliny arachidónovej (AA) a tvorba reaktívnych foriem kyslíka (ROS) so všeobecne vynikajúcim bezpečnostným profilom [3,4,5,6]. Amr a Abeer ukázali, že olej z píniových orieškov (PNO) má široký terapeutický účinok, ako je antibakteriálny, protiplesňový, antivírusový, antiseptický, expektoračný, cholagog, choleretický, diuretický a antihypertenzívny [7]. V štúdiách na ľuďoch sa preukázalo, že PNLA má protizápalové, imunitne metabolické, antireumatické a antiaterogénne účinky [5,6] spolu s vlastnosťami znižujúcimi hmotnosť [2]. Podľa mnohých štúdií majú PNO a PNLA potenciál na použitie ako anticholesterické látky [3,7,8]. V tomto prehľade zhrnieme dôkazy, ktoré naznačujú, že PNLA môže pôsobiť ako protizápalové činidlo.

2. Composition of PNLA and Pine Nuts Oils

Spotreba píniových orieškov a PNO sa za posledných niekoľko desaťročí zvýšila. Najväčší distribútori sú v Ázii vrátane Číny, Severnej Kórey a Pakistanu. Kórea, USA a Rusko sú najväčšími užívateľmi píniových orieškov a PNO [9]. Píniové oriešky majú jedinečnú chuť s veľmi vysokým obsahom kalórií a lipidov. Píniové oriešky sa skladajú z takmer 64 % tuku, 20 % bielkovín a 5 % sacharidov [10,11]. Väčšina FA v píniových orieškoch sú nenasýtené FA (UFA) s iba 10% nasýtených FA (SFA) [12]. Píniové oriešky sú dlhé 9–12 mm [13] a majú vysoký obsah oleja (45–65 g/100 g orechov) [12,13]. PNLA je nezvyčajná a jedinečná PUFA, ktorá sa nachádza iba v PNO, ako je Pinus orientalis a semená prímorskej borovice (P. pinaster), ktoré sú bohatým zdrojom PNLA [9,13]. Píniové oriešky z P. koraiensis (kórejská borovica), P. sibirica (sibírska borovica), P. gerardiana (borovica chilgoza) a P. pinea (borovica kamenná) sú najbežnejšími rodmi, ktoré konzumujú spotrebitelia [9]. Orechové oleje z P. eldarica, P. excelsa, P. pinea a P. torreyana majú nízku hladinu PNLA (v prípade P. pinea veľmi nízku) a sú bohaté na LA alebo kyselinu olejovú [14]. PNO obsahuje aj antioxidačné zložky rozpustné v lipidoch, vrátane tokoferolov, fytosterolov a skvalénu.

Zloženie FA píniových orieškov (oleje P. sibirica a P. koraiensis) bolo definované a zistilo sa, že LA (all-cis-9-, -12–18:2) je hlavnou a najhojnejšou PUFA (48,4 %) v PNO. Kyselina olejová (cis-9-18:1) je druhým najbežnejším mononenasýteným FA (MUFA) (24 %). PNLA je najbežnejšia UPIFA, zvyčajne obsahuje približne 15 až 20 % celkových FA a kyselina taxolová predstavuje asi 1,8 % [3]. Dva hlavné SFA v PNO sú kyselina palmitová (16:0) a kyselina stearová (18:0). Kórejské píniové oriešky (KPN) a sibírske píniové oriešky (SPN) sú bohatým zdrojom PNLA, ktorý tvorí až 20 % a 27 % ich celkového obsahu.

3. PNLA a jej metabolizmus

V systémoch cicavcov nebol metabolizmus PNLA dobre preskúmaný. Uvádza sa, že PNLA sa nekonvertuje na AA, ale môže znížiť hladiny AA vo frakcii fosfatidylinozitolu buniek HepG2 zo 16 % na 8,7 % [15]. PNLA sa rýchlo začleňuje, metabolizuje a predlžuje na kyselinu Δ-7 eikosatriénovú (7 ETA; všetky cis-7, -11, -14-20:3) systémom predĺženia FA. Po liečbe PNLA sa vysoký podiel (až 30 %) ETA nachádza v rôznych bunkových membránach PL [16,17,18,19,20,21,22]. Malá časť tohto predĺženého metabolitu sa ďalej predĺži za vzniku formy (cis-9,-13,-16–22:3). Množstvo PNLA a jej metabolitov, ktoré sú začlenené do bunkovej membrány, je ovplyvnené koncentráciou PNLA a trvaním inkubácie [17,19,20]. Napríklad hladina formy Δ-9,-13,-16–22:3 v makrofágoch RAW264,7 sa zvyšovala so zvyšujúcim sa množstvom PNLA v kultivačnom médiu a inkubačným časom [16]. PNLA zmenila zloženie FA v PL v myších makrofágoch RAW264.7 so znížením hladín 18- a 20-uhlíkových PUFA a zvýšením 22-uhlíkových FA [16]. To znamená, že hladiny SFA klesajú, zatiaľ čo UFA sa zvyšuje v PL frakcii; to môže byť jeden z dôvodov protizápalových účinkov PNLA. Obrázok 2 ukazuje metabolickú dráhu PNLA.

Elongáza 5, enzým kódovaný génom Elongáza veľmi dlhých mastných kyselín 5 (ELOVL5), predlžuje mono- a polynenasýtené FA s dĺžkou 18–20 uhlíkov. Elongáza 5 katalyzuje cyklus predlžovania FA s dlhým reťazcom a je počiatočným krokom a krokom obmedzujúcim rýchlosť. Je tiež zodpovedný za predĺženie PNLA, ako sa nedávno ukázalo a ukázalo [20]. Väčšina protizápalových účinkov, ako je zníženie tvorby zápalových mediátorov, vrátane interleukínu (IL)-1β, IL-6, faktora nekrózy nádoru (TNF)-α a prostaglandínu (PG)E2, v EA. endotelová bunková línia hy296 po inkubácii PNLA bola oslabená umlčaním elongázy 5, čo naznačuje, že PNLA pôsobí prostredníctvom produktu predlžovania [20].

Tanaka a kol. v roku 2007 študovali metabolickú dráhu niektorých PUFA odvodených z ihličnatého oleja (kyselina sciadonová a kyselina borievcová), ktoré boli metabolizované na esenciálne FA v živočíšnych bunkách; nahromadená LA bola predĺžená v mikrozómoch pečene potkanov a predpokladalo sa, že kyselina sciadonová prešla β-oxidačnou cestou [23]. Podobne štúdie in vitro založené na mikrozómoch pečene potkanov zistili C2-predĺžený metabolit PNLA, hoci sa nenašiel v experimentoch in vivo [18]. Potenciálnym dôvodom týchto kontrastných pozorovaní je, že in vivo môže byť C2-predĺžený metabolit PNLA rýchlo translokovaný do mitochondrií a podliehať β-oxidácii. Väčšina diétnych linoleátov a K-linolenátov u potkanov bola β-oxidovaná, pričom iba 3,0 % a 1,4 % sa premenilo na dlhšie PUFA [18]. Pretože PNLA je substrátom karnitín-palmitoyltransferázy I ako K-linolenátu, prakticky všetka PNLA v oleji z borovicových semien (PSO) bola oxidovaná mitochondriálnou β-oxidačnou cestou, preto sa C2 reťazcom predĺžený metabolit PNLA pravdepodobne nemusí dostať na úroveň pozorovanú v experimentoch in vitro [18].

4. PNO a PNLA inhibujú zápalovú reakciu

Protizápalové účinky PNO boli preukázané na zvieracích modeloch in vitro a in vivo [3,4,10,24], ktoré boli preukázané aj pri PNLA [5,6,15,16,17,19,25]. Diétne PUFA ovplyvňujú zápal niekoľkými mechanizmami, vrátane zmeny funkcie a štruktúry membrány a regulácie syntézy lipidových mediátorov [1,26]. Nedávno Takala a kol. ukázali, že protizápalové účinky PNLA sú spojené so zmenami v génovej expresii a intracelulárnych signalizačných sieťach [5,6], pričom potlačenie NF-κB [5,6,20,26] a prevodník signálu a aktivátor transkripcie (STAT) sú kľúčovými potenciálnymi mechanizmami [5,6]. Takéto transkripčné faktory by mohli potenciálne regulovať enzýmy vrátane cyklooxygenázy-2 (COX-2) a indukovateľnej syntázy oxidu dusnatého (iNOS), ako aj prozápalových cytokínov, ako sú TNF-α a IL-6. Okrem toho bioinformatická analýza [5] naznačila, že by sa stimulovali protizápalové transkripčné faktory vrátane PPAR [4,5,6,27,28] a jeho koaktivátora PPAR-koaktivátora 1-alfa (PGC-1α). PGC-1α je produktom génu PPARGC1A. PPAR inhibuje NF-κB, STAT1, aktivačný proteín 1 (AP-1) a STAT3. Okrem toho PNO a PNLA inhibujú produkciu NO [3,17], PGE2 [5,16,17] a prozápalových cytokínov [3,5,17,19]. Celkové protizápalové účinky PNLA a PNO sú zhrnuté v tabuľke 1.

5. PNO and PNLA Inhibit Oxidative Reactions

Dietary antioxidants may improve chronic diseases by reducing oxidative damage [33]. Antioxidant enzymes are essential for cell defense against the harm that free radicals may do to cells and macromolecules. Two of these enzymes are phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD). P. koraiensis oil was included in a meal given to rats, and they showed elevated blood levels of SOD and GSH-Px activity [34]. Malondialdehyde (MDA) is a sign of lipid degradation caused by free radicals and is commonly used as a biomarker for measuring lipid peroxidation in cell membranes. There was a reduction in serum MDA levels in the PNO-fed group relative to the control [34]. Additionally, in comparison to the controls, the pine high-fat diet (PHFD) group had the greatest level of SOD2 mRNA compared to PNO and soybean oil (SBO)-fed groups and soybean high-fat diet (SHFD) groups [34], which might shield from damage due to ROS. In H₂O₂-induced HepG2 cells, 1, 5, and 10 μM of PNLA, dose-dependently reduced intracellular ROS accumulation by 29.1, 59.1, and 65.5% and intracellular MDA content by 15.96%, 20.5%, and 22.9%, respectively [35]. These data suggest that PNLA reduces ROS-induced lipid peroxidation, thereby decreasing oxidative damage [3]. Although Takala et al. found that PNLA (25–100 μM) has no effect on ROS in THP-1 monocytes and macrophages in vitro [5], they found that 25 μM PNLA reduced NO production by PBMCs (unpublished observation). NO is considered one of the oxidative stress mediators.

Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) was translocated to the nucleus by PNLA in order to protect cells from oxidative stress, and the expression of the antioxidant enzymes heme oxygenase-1 (HO-1) and quinone dehydrogenase-1 that are downstream of NRF2 was also increased [35]. The NRF2 transcription factor is a key regulator in cellular antioxidant defense responses [36]. The Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1) expression was decreased; according to Zhao et al., these changes also activate the production of antioxidant enzymes leading to a decrease in MDA production, which protects against damage by ROS [35].

Oxidative damage and repair are perpetual processes in vivo. Inflammation is exacerbated by oxidative damage, which is increased when damaged biomolecules are not replaced [37,38]. Under inflammatory conditions, as shown in Figure 3, hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), a member of the basic ARNT-protein family and typically a heterodimer consisting of HIF-1α and HIF-1β subunits, provides a means of regulating gene expression that operates at a molecular level in response to the availability of oxygen. This idea inspired the production of medications that have been licensed for inhibiting HIF-1 [39]. HIF-1 activates pro-inflammatory genes such as NF-κB and STATs. STATs, once phosphorylated by activated Janus Kinases (JAKs), enables the production of cytokines that are pro-inflammatory. A transcription factor called Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2 (ARNT2) controls the transcription of HIF-1. ARNT2 expression was found to be inhibited by 25 μM PNLA in PBMCs from RA patients (unpublished data). Takala et al. also found that oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the most significant canonical pathway to be inhibited in purified CD14 monocytes isolated from active RA patients followed by mitochondrial dysfunction [6]. PNLA potentially reduces lactate dehydrogenase (LDH) via activation of PDK4, which leads to less lactate and acetyl CoA that consequently results in the inhibition of OXPHOS [6]. By inhibiting OXPHOS, PNLA may reduce the ability of pathogenic cells to generate sufficient ATP to survive, proliferate, and function, thus promoting the resolution of inflammation through metabolic reprogramming. Some of the putative molecular activities of PNLA based on the control of OXPHOS are summarized in Figure 3. It may be possible to gain insight into the interaction between inflammation, immunological metabolism, and some antioxidant protective activities of PNLA by learning more about the factors that affect the way that PNLA functions in chronic inflammatory disorders.

6. PNLA and PNO protect against Hyperlipidaemia and Atherosclerosis and Regulate the Lipid and Metabolic State Based on Cell Line, Animal, and Human Studies

The imbalance between exercise and dietary intake is considered the main cause of an increase in body fat [40,41]. An increase in body fat, especially visceral fat, is associated with diseases, including osteoarthritis, cardiovascular disease (CVD), hyperlipidaemia, hypertension, and type 2 diabetes (2DM) [42,43]. Weight reduction and reducing visceral fat accumulation is therefore important for health.

Pine nuts are cholesterol-free and a good source of nutrients. According to the outcomes of studies on animals, PSO considerably reduced blood pressure and had cholesterol-lowering effects [44,45]. PNO diminished lipid accumulation in the rat liver and produced a decrease in lipid profile, lipoprotein cholesterol, and liver weight, which was concentration-dependent [7]. It had no hepatotoxic or detrimental effect on the liver as hepatic enzymes, such as serum alanine transferase (ALT), aspartate transferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP) levels, were unaffected by PNLA in rabbits [8]. Jin et al. also reported that even though there was a trend of increasing AST, ALT, protein urea nitrogen, and creatinine in animals fed with high fat diet (HFD), the levels remained normal showing that PNO was neither hepatotoxic nor nephrotoxic in mice [46].

Dietary maritime pine seed oil (MPSO) has been demonstrated to reduce TG, VLDL-triglycerides, and VLDL-cholesterol in rats in vivo, and diminished cholesterol efflux in vitro in cultured cells of mice expressing human apolipoprotein (Apo) A-I, according to a study by Asset et al. [45]. Moreover, a diet containing MPSO reduced HDL and ApoA-I levels when human ApoA-I and ApoB genes are expressed in transgenic mice. There are several hypotheses that have been suggested for hypolipidemic properties, one of them is that PNLA alters the expression of various Apo genes that have an essential role in lipid metabolism. Key proteins of HDL are ApoA-I and ApoA-II, lipoprotein remnant clearance requires ApoE, and the main component of TG-rich bioparticles is ApoC-III, which reduces VLDL lipolysis and uptake [47]. Other mechanisms that have been suggested for TAG-reducing properties of PNLA are diminished substrate availability to produce lipoproteins, lowered de novo lipid synthesis, or alterations in very low-density lipoprotein (VLDL) physicochemical properties [45,47]. Furthermore, PNLA reduced the activity of the lipid anabolic pathway in vitro in hepatoma HepG2 cells by downregulating the expression of genes associated with lipid synthesis and lipoprotein uptake. For example, long-chain acyl-CoA synthetases (ACSLs) mediates the formation of fatty acyl-CoA from FAs (lipid biosynthesis). In comparison to the BSA control group, PNLA decreased the mRNA levels of ACSL3, and ACSL4 by 30 and 20%, respectively [8].

Many inflammatory processes are generally initiated by monocyte migration; in the case of atherosclerosis, monocytes migrate from the lumen into the intima, and in RA they migrate into inflamed synovium. Monocytes once migrated undergo pathologic transformation into macrophages and commence the inflammatory process within the artery or the synovial joint. Recently, Takala et al. demonstrated that PNLA reduced migration of THP-1 monocytes induced by MCP-1 by more than a half in vitro. Macropinocytosis and DiI-oxLDL uptake were also decreased by 50% and 40% in differentiated THP-1 macrophages and by 40% and 25% in HMDM, respectively [5]. Both processes lead to lipid accumulation and the formation of atherogenic plaque.

PNO-FA induced higher internalization of Dil-LDL in HepG2 cells [48] suggesting that PNO-FA may lower LDL by increasing uptake by the liver. When compared to other oils, rats fed PNO had lower serum TAG and VLDL-TAG concentrations, according to Asset et al; however, despite the effects being relatively high, the differences were not statistically significant [45]. Lower serum total TAG levels in rats fed P. koraiensis oil compared to rats fed lard were similar but significant in findings reported by Park et al. [11].

According to Park et al. (2016), the PHFD group’s response on fatty acid synthase (FAS) mRNA expression was considerably less than that of the SHFD group. Lipogenesis was decreased in the PHFD group but not in the SHFD group [49]. After 16 weeks of feeding, Ferramosca et al. (2008) found that PNO-fed mice had considerably lower activity levels of hepatic lipogenic enzymes such as acetyl-CoA carboxylase and FAS and that PNO-fed mice were protected from liver fat accumulation when fed conjugated linoleic acid (CLA) [50,51]. Compared to SHFD, the body weight gain and mass of white adipose tissue were lower in PHFD (10% and 18% lower, respectively). In comparison to the SHFD, the PHFD had much lower liver TG levels (26% lower). Intake of PNO increased hepatic acyl-CoA dehydrogenase long chain (ACADL) mRNA levels [51]. These data indicate that PNO increases hepatic FA-β-oxidation and reduces lipogenesis.

Predpokladalo sa, že PNLA aktivuje PPAR u pacientov s RA a u zdravých dobrovoľníkov [5,6]. PPAR-γ zvýšil výtok cholesterolu z makrofágov pečeňovou dráhou receptora X pečene [52,53]. Okrem toho PPAR-γ reguluje diferenciáciu adipocytov a homeostázu glukózy, ako aj črevnú homeostázu prostredníctvom modulácie prozápalových reakcií sprostredkovaných NF-κB [52,53,54]. Nízky PPAR-γ znižuje ukladanie tuku v tukovom tkanive, čo vedie k ukladaniu tuku v tukových tkanivách. PPAR-γ tiež reguluje hladinu leptínu v plazme, citlivosť na inzulín, homeostázu glukózy a krvný tlak, ako aj účinky antidiabetík. Okrem toho zabraňuje uvoľňovaniu zápalových cytokínov a aktivácii makrofágov [52]. Ateroskleróza na zvieracích modeloch a štúdiách na ľuďoch je inhibovaná agonistami PPAR [52,55,56], takže sú potenciálnou liečbou KVO a 2DM [57,58]. To všetko naznačuje, že existuje metabolický prospešný účinok PNLA, ktorý môže byť sprostredkovaný aktiváciou PPAR-γ, aj keď existuje kontroverzia týkajúca sa PNO efektu, ktorý môže znížiť PPAR-γ, ako uvádza [46].

V porovnaní so svetlicovým olejom (SAO) olej z Pinus koraiensis znížil hladinu cholesterolu v krvi a znížil zvýšenie krvného tlaku u potkanov spojené s vekom, hoci ľanový olej (FSO) bol v tejto štúdii účinnejší ako PNO [44]. PNO stimulovalo produkciu CHZO aorty viac ako SAO a rozdiel medzi skupinami PNO a SAO bol významný. Liečba PNO tiež zabránila zvýšeniu krvného tlaku súvisiacemu so starnutím po 5 týždňoch a pretrvávala počas 8 týždňov [44]. Autori dospeli k záveru, že extrakty z píniových orieškov nielen znižujú krvný tlak, ale znižujú aj poškodenie obličiek spôsobené hypertenziou. Výťažky z borovicovej kôry a píniové oriešky tiež preukázali sľubné kardiovaskulárne (CV) výhody, vrátane zlepšenia funkcie endotelu, zníženia plazmatického fibrinogénu a zníženia viskozity plazmy a systolického krvného tlaku [3,27,59,60]. Tieto výsledky boli pripísané rôznym typom FA v píniových orieškoch, najmä PNLA alebo niektorým jej metabolitom. V štúdii Amra a Abeera sa u potkanov kŕmených stravou s vysokým obsahom tukov vyvinula zahustená tunica media spojená s množením hladkého svalstva v aorte, okrem vakulácie tunica media v aorte. V druhej skupine potkanov mala cholesterolová strava doplnená o 5 a 10% píniových orieškov vakuoly tunica media. V tretej skupine však potkany kŕmené stravou doplnenou 15% píniových orieškov vykazovali normálnu histologickú štruktúru [7].

V porovnaní s kukuričným olejom v akútnom myšom glukózovom tolerančnom teste PNO a čistá PNLA (voľná a esterifikovaná) podstatne zlepšili glukózovú toleranciu [61]. Výsledky in vitro naznačili, že PNLA je silný agonista duálneho voľného FA receptora-1 a voľného FA receptora-4 (FFA1/FFA4) [61,62], ktorý má antidiabetické účinky. Rôzne typy neesterifikovaných FA so stredným až dlhým reťazcom (NEFA) boli spojené rôznymi spôsobmi pri 2DM a iných metabolických a zápalových ochoreniach a FFA1 a FFA4 sú transmembránové receptory spojené s G proteínom, ktoré sú aktivované týmito NEFA. FFA1 je exprimovaný v β bunkách pankreasu, zatiaľ čo FFA4 je exprimovaný v črevných enteroendokrinných bunkách, makrofágoch, pankrease, tukovom tkanive a mozgu. Zdá sa, že koaktivácia FFA1 zvyšuje produkciu inzulínu, ktorý je závislý od glukózy [63,64] a FFA4 podporuje citlivosť na inzulín a má protizápalové účinky [65,66]. Etylénom prerušená PNLA patrila medzi najúčinnejšie NEFA na FFA1 a FFA4 v porovnaní s ALA, AA, DGLA a GLA. PNLA prekonala všetky tieto FA v podpore zdravia a zlepšení citlivosti na inzulín [61].

In various studies where mice are given HFDs containing PNO, there was weight reduction and less weight gain [31,49]. White adipose tissue mass was decreased because of these alterations [31,49,67], most likely as a result of increased oxidative metabolism and thermogenesis, which drives the utilization of fuel sources and reduces lipid accumulations. Therefore, the effect of PNO and PNLA on weight could be the result of both increased energy expenditure and decreased intake. Earlier in 2008, Hughes et al. reported a rise in the satiety hormones glucagon-like peptides (GLP-1) and cholecystokinin (CCK-8), in postmenopausal obese women participating in a pilot double-blind placebo-controlled clinical trial [2,68] when taking 3 g Korean pine nuts (KPN)-FFA in comparison with 3 g KPN-TG or 3 g olive oil. The levels of circulating CCK-8 in the PNO FFA and PNO TAG groups, respectively, were 60% and 22% higher. Comparing the PNO FFA group to the control, GLP-1 rose by 25% [2, 69]. Food intake also diminished by 36% in the PNO FFA group [2,68,69] suggesting that pine nuts may also be an appetite suppressant.

7. Novel Potential Metabolic, Anti-Inflammatory, and Immune-Regulatory Effects Discovered by Transcriptomic and Bioinformatic Analyses

In C57BL/6 mice, Zhu et al. discovered decreased hepatic mRNA expression of ACADL, adipose triglyceride lipase (ATGL), carnitine palmitoyltransferase (CPT) 1A, and Apo-B100 as well as decreased gut mRNA expression of both CD36 and Apo-A4 [67]. This implies that dietary PNO may reduce the uptake of intestinal FA and increase hepatic mitochondrial FA oxidation.

PNLA downregulated the expression of genes related to FA biosynthesis (fatty acid synthase (FAS), sterol regulatory element-binding protein 1(SREBP1), and stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1)) in the human hepatoma cell line (HepG2) when compared to control (53, 54, and 38% lower, respectively). Furthermore, the mRNA levels of genes related to cholesterol synthesis and lipoprotein uptake (3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase (HMGCR), and LDL receptor (LDLr), respectively) were significantly suppressed (30, and 43%, respectively) by PNLA [8,27]. The cholesterol-reducing capability of PNLA has been associated with a greater hepatic accumulation of PNLA and regulation of hepatic activity through boosted hepatic LDLr gene expression and elevated levels of SREBP2 [70].

Studies of protein–protein interaction networks (PPINs) by bioinformatic analyses are crucial for delineating how intracellular proteins work. Investigating a protein’s interaction with other proteins whose activities are known can help reveal those proteins whose functions are not fully identified [46]. Therefore, PPIN analysis was conducted to shed light on the molecular mechanisms underlying PNLA’s metabolic and immunological effects as demonstrated by Takala et al. [5,6] and Jin et al [46]. Takala et al. identified that 25 μM PNLA treatment of LPS-activated CD14 monocytes activated Kruppel-like factor 15 (KLF15), argonoute-2 (AGO2), ficolin (FLCN), Sirtuin3 (SIRT3) and Sirtuin signalling pathways and reduced the activity of STAT3, Transcription factor E3 (TFE3), and Death associated protein-3 (DAP3) pathways [5,6].

KLF15 je transkripčný faktor, ktorý riadi zápal a iné patogénne procesy spojené s aterosklerózou, ako aj kontrolu rôznych signálnych dráh [71]. Moduluje stav acetylácie a aktivitu NF-κB a riadi aktiváciu buniek hladkého svalstva ciev (VSMC) [72]. Niekoľko kardiovaskulárnych ochorení, vrátane srdcového zlyhania, progresívnej zápalovej vaskulopatie a aneuryzmy aorty, bolo spojených so zníženou expresiou KLF15 [71]. Expresia mRNA KLF15 je znížená v aterosklerotickom tkanive ľudskej aorty v porovnaní s neaterosklerotickými kontrolnými aortami [71]. Nadmerná expresia KLF15 v ľudských bunkách EA.hy926 vykazovala ochranný účinok proti dysfunkcii vyvolanej TNF-α a znížila hladiny fosfo-p65 (p-p65), ICAM-1, MCP-1 a TGF-β [71]. AGO2 hrá úlohu pri interferencii RNA a umlčanie miRNA je ovplyvnené proteínmi Ago [73,74,75]. Pôsobenie PNLA môže byť čiastočne sprostredkované jej účinkom na AGO2, a tým aj na prozápalové miRNA. V aktivovaných makrofágoch TFEB a TFE3 riadia autofágiu a lyzozomálnu aktivitu a sú rozhodujúce pre transkripciu prozápalových cytokínov, ako sú TNF-α a IL-1β [76]. DAP3 je malý podjednotkový proteín nachádzajúci sa v mitochondriálnom ribozóme, ktorý sa podieľa na mitochondriálnej funkcii a rôznych formách bunkovej smrti [77]. Nadmerná expresia DAP3 vedie k zvýšeniu bunkovej smrti a osteoklastogenézy [77]. DAP3 pôsobí po pro-apoptotických cytokínových stimuloch, ako je IFN-γ a pred niekoľkými kaspázami, najmä kaspázami 8 a 9 [77]. Niektoré z účinkov PNLA môžu byť sprostredkované jeho inhibičným účinkom na DAP3, ako je apoptóza a inhibičný účinok týchto prozápalových cytokínov. V PBMC od zdravých dobrovoľníkov PNLA dramaticky zvýšila expresiu PAI-1, ktorý produkuje proteín, ktorý inhibuje enzýmy zodpovedné za tvorbu plazmínu z plazminogénu, tkanivového aktivátora plazminogénu (tPA) a aktivátora uro-plazminogénu (uPA). V synovii RA je expresia uPA vysoká vo vrstvách synoviálnej výstelky [78]. U TNF-transgénnych myší nedostatok plazminogénu znižuje synoviálny zápal a degeneráciu kĺbov prostredníctvom zníženia cytokínov a matricových metaloproteináz (MMP) [79].

FBP1 je súčasťou glykolytickej dráhy, ktorou sa fosforyluje fruktóza-6-fosfát. Expresia génu pre FBP bola tiež zvýšená PNLA v PBMC od pacientov s RA. Má protizápalové vlastnosti a podávanie FBP znižuje artritídu so zníženým opuchom kĺbov a prozápalovými hladinami cytokínov [80].

Expresia ACADL a PPAR-α, γ a δ mRNA bola zvýšená v ľudských PBMC a monocytoch CD14 [5,6]. PNLA potenciálne vyvolala aktivitu ligandu pre PPAR-α a PPAR-δ, pretože liečba týmto FA zvýšila cieľové gény PPAR-α a PPAR-δ zapojených do oxidácie FA, vrátane receptora-gama koaktivátora aktivovaného peroxizómovým proliferátorom (PGC)-1α, mitochondriálneho oddeľovacieho proteínu 3 (UCP3), karnitín palmitoyltransferázy 1B (CPT1b), stredného reťazca acyl-CoA dehydrogenázy (ACADM) a ACADL v bunkovej línii myotrubíc C2C12 [34] a PBMC od pacientov s HC a RA [5]. Park a kol. navrhli, že ligandová aktivita PNLA pre PPAR-α a PPAR-δ môže byť hlavným mechanizmom zníženej adipozity u myší kŕmených PNO [31,49]. Túto aktiváciu naznačili aj iní ako jeden z dôvodov protizápalových vlastností PNLA, ako je inhibícia AP-1, NF-κB a STAT [5,27,81]. Na určenie, či PNO ovplyvnilo hladiny expresie PPAR-γ a SREBP-1c v tukovom tkanive nadsemenníka, Jin a kol. použili RT-PCR. Zatiaľ čo orlistat, liek na chudnutie, a skupiny PNO vykazovali významnú reguláciu expresie PPAR-γ v tukovom tkanive nadsemenníka v porovnaní so skupinou HFD, expresia PPAR-γ bola zvýšená v skupine HFD v porovnaní so skupinou s normálnou stravou (ND) [46]. PNO (822 a 1644 mg/kg) znížil upreguláciu mRNA leptínu v nadsemenníku v porovnaní so skupinou HFD spôsobom závislým od dávky. Okrem toho PNO tiež znížil expresiu mRNA lipoproteínovej lipázy (LPL).

Pri chronickom obmedzení kalórií (CR) je známe, že SIRT, deacetyláza závislá od NAD + triedy 3, je zvýšená. SIRT znižujú expresiu génov, ktoré podporujú aterosklerózu [6,82,83]. SIRT3 je v podmienkach CR zvýšená regulácia a hrá zásadnú úlohu pri riadení mitochondriálnej funkcie. SIRT3 je primárna mitochondriálna forma, ktorá podporuje oxidáciu FA, posilňuje antioxidačný obranný systém a opravuje poškodenie mitochondriálnej DNA [82]. Pri obezite vyvolanej HFD konzumácia PNO znížila telesný tuk a akumuláciu TG v pečeni [49]. SIRT3 je nový cieľ ochrany pred lipotoxicitou a metabolickými problémami súvisiacimi s obezitou [82]. Expresia génu SIRT3 bola zvýšená o 25 μM PNLA v purifikovaných monocytoch od pacientov s RA [6]. Expresia proteínu SIRT3 bola zvýšená v bielom tukovom tkanive myší kŕmených PNO [34]. Najmä NF-κB RelA/p65, transkripčný faktor rodiny AP-1 c-Jun a c-Myc sú častými substrátmi SIRT1. SIRT1 deacetyloval RelA/p65 a znížil aktivitu NF-κB [84,85,86]. SIRT1 významne znížil produkciu IL-12 v ľudských dendritických bunkách (DC) prostredníctvom svojho vplyvu na transkripčný faktor NF-κB c-Rel [84,85]. Okrem toho ďalšie štúdie ukázali, že SIRT1 v chondrocytoch a synoviálnych bunkách reguluje rôzne typy buniek počas zápalovej artritídy [84,85,87]. Správy tiež potvrdili, že hladiny TNFα indukované LPS v monocytoch boli znížené nadmernou expresiou neaktívnej formy SIRT1 [87].

8. PNLA and Modulation of miRNAs

Takala et al., for the first time, showed a novel correlation between the relative expression levels of the miRNA’s targets and PNLA treatment. The miRNAs that were up or downregulated from 8 RA patients’ pure monocytes with active disease are summarized in Table 5. Monocytes upon PNLA treatment and LPS stimulation versus vehicle treatment and LPS stimulation resulted in differential expression of 68 miRNAs, 8 down-regulated and 60 up-regulated [6].

Table 6 displays the pathways connected to inflammation and lipid/cell metabolism that PNLA may control. The targets of these miRNAs were discovered through bioinformatic analyses to be several metabolic and anti-inflammatory mRNAs, including pyruvate dehydrogenase kinase-4 (PDK4), single-immunoglobulin interleukin-1 receptor-related molecule (SIGIRR), mitochondrial-ATP-6 (MT-ATP6), ghrelin and obestatin prepro-peptide (GHRL), jumonji domain containing 7-phospholipase A2 (JMJD7-PLA2G4B), and electron transfer flavoprotein subunit alpha (EFTA). These genes play a role in the control of inflammation, mitochondrial dysfunction, and lipid and cell metabolism. Adipocyte function, glucose metabolism, insulin secretion signalling pathways, CCK secretion, mitochondrial ATP synthase, the NAD signalling pathway, and FA β-oxidation were among the metabolic signalling pathways identified.

Ten miRNAs target PDK4, which controls TNF-α and NF-κB [5,88]; miR-3173, miR-2861, miR-626, miR-28, miR-7150, miR-3188, miR-879-5p, miR-393-5p, miR-708-5p, and miR-12118 [6]. Cellular metabolism depends on PDK4, and PDK4 deficiencies result in the death of hepatocytes by apoptosis with an increase in mitochondrial numbers, ROS production, prolonged activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK), and decreased glutathione levels. Intracellularly, PDK4 can interact with proteins with death domains such as NF-κB and retain them in the cytoplasm [88]. According to the IPA database, three miRNAs, miR-7150, miR-1909-3p, and miR-6868-5p, target SIGIRR [6], which is a downstream regulator of TNF-α, IL-1β, TRIM1 and NF-κB signalling pathways. SIGIRR blocks IL-1R and TLR signalling by interacting with interleukin-1 receptor-associated kinase 1(IRAK-1), a protein linked with the interleukin-1 receptor, and TNF receptor-associated factor 6 (TRAF-6) [89]. Overexpression of SIGIRR reduced TLR-induced production of IL-10, TNF-α, and IFN-γ-induced protein 10 (IP-10) in DCs and HMDMs. Mice lacking SIGIRR experienced more severe collagen-induced arthritis (CIA) [89]. The suppression of naturally produced cytokines was caused by overexpression of SIGIRR in human RA synoviocytes [89]. MT-ATP6 is essential for mitochondrial function, sirtuin signalling, OXPHOS, and glucocorticoid receptor signalling [6]. Let7s are a family of miRNAs that have been shown to have established anti-atherogenic and anti-inflammatory effects. These effects include the control of smooth muscle cells and vascular endothelial cells, both of which are crucial for the emergence of atherosclerosis [74,75]. VSMC migration and proliferation is influenced by Let7 negative feedback control [74].

9. Discussion and Conclusions

Studies indicate that PNLA has potential benefits as a dietary supplement or complementary therapy for chronic inflammatory and immune diseases as well as metabolic disorders. Anti-inflammatory and lipid-lowering drugs (e.g., immunosuppressives, fibrates, statins, bile acid sequestrants, etc.) reduce disease symptoms and reduce lipid levels through various mechanisms but often have adverse side effects. Additionally, considerable residual activity for the disease is often associated with such drugs. Therefore, additional research and clinical trials are required to reinforce PNLA’s anti-inflammatory effects to be included in medical treatment for patients. For example, studies on the role of PNLA on atherosclerosis could include mouse models of the disease or associated risk factors [90,91,92]. Some of the differences in findings on PNLA in the literature could represent different sensitivities of various cell types to the FA, or they could be a result of variation in experimental designs (e.g., inflammatory stimulant, FA concentration, incubation time). However, when considered collectively, current research and older studies show that PNLA may be capable of reducing the production of a plethora of pro-inflammatory cytokines, and oxidative mediators [5,19,27]. Data suggest that PNO and PNLA lower plasma lipids, including both cholesterol and TAG [2,67]. Pine nuts also include a variety of non-PNLA compounds that may have anti-inflammatory and metabolic effects. More research is needed to explore their potential. The unique UPIFA structure in PNLA might prevent it or its major metabolite (ETA) from being metabolised into PGE2. The latter at a lower concentration may reduce COX-2 expression, which as a result decreases the production of MMP in colon cancer cells [93], which further supports the anti-inflammatory effect of PNLA. PGE2 leads to inflammatory pain, and the reduction of PGE2 was also confirmed by Takala et al. in samples from HCs and RA patients [5].

In HepG2 cells and mouse livers, PNLA and pine nuts regulate lipoprotein uptake and reduce the expression of genes involved in FA biosynthesis [25,67]. Furthermore, PNO has several actions that lead to enhanced energy expenditure by increased oxidative metabolism via brown adipose tissue thermogenesis and decreased appetite through increased production of anti-satiety hormones. Reduced adipose tissue deposition, weight gain, and ectopic fat deposition all could result from these effects. Accordingly, PNO increased the expression of genes related to FA oxidation, mitochondrial oxidation, and oxidative metabolism in skeletal muscle [4]. This may explain the ability of PNO and PNLA to regulate muscle and cellular OXPHOS and metabolism.

There is little research on humans because many of the experiments covered in this review were carried out on cell lines or in animal models. Additionally, studies have been of short duration, so the long-term impact has not been established. High-quality clinical trials in humans for both PNO and PNLA will be necessary to establish the optimal doses and their effects on health and diseases. In addition, a well-known, important gut hormone glucagon-like peptide-1 (GLP-1) controls appetites, body weight, and glucose metabolism, which are controlled by PNO and PNLA. It is therefore important to determine whether formulation such as hydrolysed PNO in slow-release capsules may have additional positive impacts specifically in individuals with prediabetes or overt 2DM, in well-powered short- and long-term trials.

10. Prospects and Future Directions

Even though PNLA has biological activity, not all PNO’s effects might be attributable to it. As previously mentioned, pine nuts and PNO include a variety of additional, frequently at modest levels, molecules with potential biological activity, such as phytosterols, tocopherols, and squalene. It will be crucial to distinguish the effects of PNLA from those of the other components of PNO and not to ignore the potential contribution of these components to any biological effect identified for PNO. To assess their potential more accurately, it will be fundamental and worthwhile to examine how this FA affects the metabolism and mediates its anti-inflammatory effects. One such aspect is the lack of evaluation of PNLA’s effects on synovial histology and radiographic progression, as well as their function in early arthritis and their interaction with biologic medications.

Author Contributions

R.T. conceived the idea for this initiative. R.T. contributed to reading the literature, preparation of figures and tables, and writing—original draft preparation. D.P.R. and E.C. assisted with writing, reviewing, and editing. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

Institutional Review Board Statement

Not applicable.

Informed Consent Statement

Not applicable.

Data Availability Statement

Not applicable.

Conflicts of Interest

The authors declare no conflict of interest.

Funding Statement

This research received no external funding.